E50 og karse

Introduktion

For at kunne vurdere hvor farligt et pesticid eller andet miljøfremmed stof er, har man brug for at kunne måle giftigheden af det på levende organismer.

Det bruger man testen, ”LC 50” til. LC står for lethal concentration, som oversat til dansk betyder dødelig koncentration. Denne test kaldes også E50, hvor E står for Effekt.

E 50 testen handler om at at finde ud af, hvor meget af et stof man kan give en gruppe af ens organismer i et forsøg, før 50% af forsøgsgruppen er død eller markant hæmmet. 
Ud fra dette resultat kan man så fastsætte, hvor høj en koncentration af fx et pesticid man vil tillade i vandet i en grundvandsboring, før den udgør en sundhedsrisiko.

karseforsøg med ethanol

Formål

Formålet med dette forsøg er at give en forståelse for, hvordan man udarbejder en E50, samt en bredere forståelse for hvordan man videnskabeligt måler giftigheden af et stof. Når først man har lært metoden kan den anvendes på test af mange andre stoffer end det aktuelle i denne protokol.

Mål

Målet er at finde frem til den koncentration af husholdningssprit, der hæmmer karsen, så det vokser halvt så effektivt som ved normale betingelser , Og derved finde E50 for husholdningssprit på karse.

Sikkerhed

I grundskolen, må man ikke arbejde med stoffer der er giftige i små mængder. Derfor er de meget giftige kemikalier erstattet med kemikalier fra hverdagen. Hverdagskemikalier vil i store koncentrationer og ved længere tids eksponering være giftige for de udvalgte organismer.

Modelorganismen, der benyttes i E50-forsøget til at teste giftighed på er i dette tilfælde almindelig karse.
Det stof som der testes giftighed af er 90% husholdningssprit, som består af 90 % ethanol tilsat denatureringsmiddel, og 10% vand.  

Materialer

Vedlagt i kittet

  • 5 små petriskåle med låg
  • vat
  • 125 karsefrø fra den samme batch/leverandør
  • 5 falconrør - 15 ml (eller bægerglas, som alternativ)
  • Tandstikker til at håndtere karsefrø

Skaffes i naturfagslokalet på skolen:

  • 10 cl husholdningssprit
  • tusser der kan skrive på petriskåle/plastic
  • saks
  • lineal 
  • vand

Metode

Forsøget består af tre dele. 

  • Først skal fortyndingsrækken laves. 
  • Herefter skal karsen sås i vat i petriskålene.  
  • Efter 4-6 dage skal karsen høstes og, 
  • databehandlingen kan nu laves.

Fortyndingsrække

  • Tag de 5 Falconrør. benyt alternativt måleglas med volumen på minimum 25 ml.
  • Du skal skrive på dem så du kan kende forskel. Skriv derfor hhv. “1, 2, 3, 4 og kontrol”på .
  • Tilsæt 13,5 ml ml postevand i hvert af rørene med nummer 1, 2, 3 og 4. – sæt låg på hver gang du er færdig.
  • Tilsæt 15 ml vand i kontrolrøret.
  • Tilsæt nu 1,5 ml husholdningssprit 90% til rør1, sæt låg på og ryst rør 1 så spritten blandes med vandet. 
  • Her efter tages 1,5 ml fra rør 1 og overføres til rør 2. Ryst nu rør 2 og, 
  • overfør 1,5 ml af fortyndingen fra rør 2  til rør 3. 
  • Ryst  rør 3 og overfør 1,5 ml derfra til rør 4.

Du har nu lavet din fortyndingsrække, som du skal bruge senere.

Du kan faktisk selv observere at spritten er blevet fortyndet.
Hvis du vifter med hånden over røret med fortyndingen mod dine næsebor, kan du lugte spritten. Hvis du lugter til dem alle 4, vil du formentlig lægge mærke til at sprit-lugten bliver svagere ned gennem fortyndingsrækken.

Såning

  • Tag de fem petriskåle frem, og navngiv dem på top og bund, som du gjorde med glassene i fortyndingsrækken: 1,2,3,4 og K.

  • Kom vat i bunden af petriskålene.

  • Overfør fortyndingerne til petriskålene med det tilsvarende nummer. Du skal være meget opmærksom på at den rigtige fortynding tilføres den rigtige petriskål. 

  • Start med at sætte låget på alle petriskåle og behold dem på hele tiden, undtagen når der arbejdes med dem. 

  • Start med fortyndingen i rør 1 og petriskål 1. Brug engangspipetten til at optage væsken og dryp den forsigtigt ud over vattet.
     
  • Vattet skal være gennemvædet, men der må ikke flyde væske. Er der kommet for meget væske i kan det suges op med pippetten. 
    billede der viser, hvordan karsefrø skal placeres i petriskål
  • Når vattet er gennemvædet skal 25 frø fordeles oven på vattet. 

  • Frøene skal lægges i 5 rækker bestående af 5 frø. Se tegning og billede. På denne måde kan du hurtigt og nemt kontrollere at du har 25 frø i alt. Brug evt. en tandstikker til at så frøene rigtigt i rækker. 
  • Vær opmærksom på at holde orden så de rigtige låg kommer på de samme petriskåle. Der skal være låg på dem alle sammen.  

  • Stil petriskålene i en vinduskarm med daglig sol og lad dem stå 4-6 dage.
    Hold øje med om vattet stadig er fugtigt.
    Bliver det for tørt så tilfør væske fra dine fortyndinger, som du skal gemme med låg/plastfilm på.

Høst og resultater

  • Tag et billede af alle dine 5 petriskåle med låget taget af. 

  • Nu skal længden af karsen måles. Start med fortynding 1. 

  • Klip karsen helt nede ved til roden. Vær opmærksom på hvor stængel slutter og roden begynder. Roden kan sagtens ligge oven på
    vattet. Roden er oftere en lysegrøn til hvid farve i forhold til stænglen. Roden har også små rodhår som nogle gange stritter ud fra den.
     
  • Mål den samlede længde af bladkrone og stængel. Forsøg ikke at rette stænglerne ud hvis de er krøllede eller bøjede, da dette kan være en effekt af giftstoffet.

  • beregn gennemsnitslængden af karsen for hver af fortyndingerne samt kontrolforsøget og skriv dem ind i et regneark.

Databehandling

Normalt når man skal finde E50 laver man en dosis-respons kurve, og det kræver en del avanceret matematik. I stedet arbejder vi her med en forsimplet metode.

I denne metode finder man ud af hvor meget plantevækst der sker ved hver fortynding.

Gennemsnitslængden for kontrollen svarer til 100% vækst, da det er den vækst der sker uden noget sprit overhovedet.
Derfor kan man ud for hver fortynding regne ud hvor meget deres gennemsnitslængde svarer til i forhold til kontrollens.

Brug regnearket og følg instrukserne: 

  • indtast resultaterne for de 25 karsefrø for hver af opløsningerne og kontrolforsøget.
  • Regnearket beregner nu gennemsnitslængden for hver af fortyndingerne og kontrollen.
    Regnearket er altså kodet til at gøre dette for dig. du kan klikke på cellen, hvor resultatet står, hvis du vil hvilken funktion regnearket benytter.

  • Det regnearket nu gør er at finde hvor meget procentvis vækst der er for hver fortyndning i forhold til kontrollen. Det gør den ved at bruge denne formel: 
    procentvis vækst:  (Gennemsnits længde fortynding/ gennemsnits længde Kontrol) *100

  •  Disse værdier bliver brugt i det diagrammet som også er lavet i regnearket.

  • I diagrammet kan du se at punkterne ud for hver opløsning passer med den procentvise vækst.
    regnearket har lavet en linje som er den bedst tilpassede mellem de fire punkter i diagrammet.

  • Du kan nu bruge denne tendenslinje til at se hvor fortyndingen der ville kunne ville give 50% vækst.  Se også anvisningen i regnearket under fanen "Eksempel og forklaring"

Arbejdsspørgsmål

  • Hvilke to fortyndinger ligger E50 imellem?
  • Hvorfor opstår der kondensvand på låget når de har stået nogle dage?
  • Hvorfor spirer ikke alle karsefrøene, ikke en gang i kontrollen?
  • Hvilken af fortyndingerne 1, 2, 3, og 4 indeholder mest sprit og hvilken indeholder mindst?
  • Kunne du se tydelig, nogen eller ingen forskel på karsefrøeness vækst i de forskellige fortyndinger? 
  • virkede den her metode overbevisende til at bestemme Effekt 50 % (E50) for karse? 
  • Hvad ville du ændre, hvis du skulle gentage forsøget med et andet stof?